BL21(DE3)Electroporation-CompetentCell50μl/支  
pUC19(controlvector，10pg/μl):10μl  
保存條件(保質(zhì)期)：-80℃（6個(gè)月）  
基因型  
F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm(DE3)  
產(chǎn)品說(shuō)明  
BL21(DE3)為L(cháng)on蛋白酶和OmpT外膜蛋白酶缺陷菌株。λ噬菌體DE3區含有T7噬菌體RNA聚合酶，該區整合于BL21的染色體上，所以稱(chēng)為BL21(DE3)。BL21(DE3)菌株可同時(shí)表達T7RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達。BL21(DE3)電擊感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉化效率達1×1010cfu/μgDNA，可用于各種多肽，蛋白表達文庫的構建。  
操作方法  
1.0.1cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。  
2.取-80℃保存的BL21(DE3)電擊感受態(tài)細胞插入冰中5分鐘，待其融化，加入目的DNA(質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手撥打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。  
A.測定轉化效率使用1μl10pg/μl的對照質(zhì)粒pUC19；  
B.對于連接產(chǎn)物，大部分公司的T4連接酶反應體系或50度反應重組體系可與BL21(DE3)電擊感受態(tài)混合后電擊轉化，無(wú)需進(jìn)行DNA純化，但DNA濃度不能過(guò)高，DNA濃度不超過(guò)100ng/μl，體積不超過(guò)5μl/50μl感受態(tài)。  
C.對鹽濃度較高的DNA溶液或反應體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液(10mMTrisHCl,pH7.5;1mMEDTA)重懸，然后與BL21(DE3)電擊感受態(tài)混合進(jìn)行電擊轉化。  
3.用200μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。  
4.啟動(dòng)電轉儀，設置參數：C=25μF，PC=200Ω，V=1.8kV(此為BioRad電轉儀推薦參數，也可按所用電轉儀推薦的參數操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。  
5.2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700μl不含抗生素的無(wú)菌S.O.C.培養基（室溫），用1ml槍吹吸電擊杯底部數次混勻后，轉移到50ml離心管（BDFalcon50ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C.培養基至10ml。37℃，225rpm復蘇60分鐘。  
6.5000rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個(gè)）。將平板倒置放于37℃培養箱過(guò)夜培養13-17小時(shí)。  
S.O.C培養基配方  
2%Tryptone  
0.5%YeastExtract  
10mMNaCl  
2.5mMKCl  
10mMMgCl2  
10mMMgSO4  
20mMglucose  
PH-7.0  
S.O.C.Mediumissuitableforuseinthefinalstepofcelltransformationtoobtain  
maximaltransformationefficiencyofE.coli(Hanahan,1983).  
注意事項  
1.加入DNA時(shí)體積不應大于感受態(tài)體積的1/10。  
2.電擊感受態(tài)細胞加入電擊杯應避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì )增加弧光放電風(fēng)險。  
3.當DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉化效率急劇下降。  
4.電擊杯里的離子可增加溶液的電導，增大在含有細胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險。  
5.若轉化大質(zhì)?；蛳氆@得較高轉化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉化效率下降一個(gè)數量級。  
6.對于連接產(chǎn)物轉化，部分公司的連接體系或重組體系(例如：Thermo，NEB公司的T4連接酶系統，NEB，天根的50度反應重組系統)可以直接與BL21(DE3)電擊感受態(tài)混合后電擊轉化，無(wú)需純化，但DNA濃度不能過(guò)高，最好不超過(guò)100ng/μl。過(guò)高濃度連接產(chǎn)物或過(guò)大體積連接產(chǎn)物會(huì )降低轉化效率，增加弧光放電的風(fēng)險。  
7.混入質(zhì)粒時(shí)應輕柔操作，吸取感受態(tài)細胞時(shí)避免用力過(guò)猛，以免剪切力過(guò)大損傷細胞膜，降低轉化效率。轉化高濃度的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物可相應減少最終用于涂板的菌量。  
8.電擊感受態(tài)細胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會(huì )導致轉化效率會(huì )下降。